生物通報道：重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術（由英國公司TwistDx Inc開發）。以此為基礎的TwistAmp® 核酸擴增產品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。

RPA擴增的基礎體系（TwistAmp® Basic）含有DNA擴增所需的所有試劑，我們只要準備好引物和模板就行。在這個基礎體系中添入不同的酶和探針，可以實現多樣化的RPA應用，比如RNA擴增檢測和實時RPA檢測等等。

RPA反應需要用多少引物？

RPA基礎反應每次需要480nM引物，TwistAmp® exo、TwistAmp® fpg和TwistAmp® nfo每次需要420nM引物。有時，稍微改動一下引物的用量可以提高其性能。對不同引物濃度進行測試（從200nM 到600nM）將有助于找到最合適的引物濃度。

RPA反應需要用多少探針？

RPA反應一般每次需要120nM探針。不過，略微改變探針的濃度有時會促進反應的進行。我們可以在一定濃度范圍內（從50nM到150nM），根據自己的具體應用對探針進行優化。

現成的PCR引物能用于RPA么？

多半不行。絕大多數PCR引物不能用于RPA，因為它們太短了重組效率低。

現成的PCR探針能用于RPA么？

不能。絕大多數常用的PCR探針并不適合RPA反應。特別是用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探針系統，這樣的酶活性與RPA根本不兼容。

怎樣才算是好引物？我應該怎樣設計RPA引物？

RPA引物還沒有一個嚴格的設計標準，所以需要進行篩選。（引物設計具體參見：PCR替代技術，RPA全攻略之引物設計）

RPA引物需要多長？

RPA引物一般在32至35個核苷酸之間。某些情況可能用到少于30個核苷酸的引物，但擴增過程會顯著減緩。

RPA引物應當相距多遠？

這取決于你的具體應用。標準TwistAmp®試劑盒適用于不超過500bp的擴增產物。RPA擴增產物的大小是沒有下限的，不過RPA引物一般需要擴增子超過80bp。擴增產物在100-200bp之間，可以實現最快的RPA擴增。

在特定條件下，RPA擴增產物能夠達到2kb。不過，目前的TwistAmp®試劑盒無法生成這么大的片段。

我需要篩選多少引物？

這取決于你對檢測靈敏度的要求。舉例來說，如果目標分子上千，那么絕大多數引物都夠用了。對靈敏度要求很高的話，最好是進行系統性的引物篩選。一開始篩選的時候，候選引物可以有10到20對。測試的引物越多，找到好引物的幾率也就越大。

篩選引物的時候必須用探針么？

不一定。任何檢測方法都可以用來評估候選引物的性能。不過對于篩選高靈敏度引物來說，用檢測探針對擴增進行實時監控被證明是最快也最省力的方法。

引物篩選時應該用什么樣的條件？

引物篩選的條件最好盡量模擬實際檢測時的條件，例如模板的拷貝數、樣本純度等等。

給定引物的性能還能再提高么？

一般來說，稍微改動一下引物的序列可以提高其RPA性能。任何給定的引物都可以通過以下方法進行優化：以單核苷酸為基礎略微改變引物的長度；或者保持引物長度不變，以1bp為基礎移動引物的位置。經過了改動的引物，需要重新進行擴增活性的測試。

RPA引物的熔解溫度應該是多少？

RPA反應是在常溫下進行的，DNA的解鏈與PCR有很大不同。傳統估算的熔點不適用于這個系統。

RPA引物需要特別純化么？

在進行引物篩選的時候，一般不需要純化。在其他情況下，引物的質量會造成批次間的差異。如果對一致性要求比較嚴格，最好先純化引物再進行RPA反應。

經過一種TwistAmp®試劑盒測試的引物，能直接用于其它TwistAmp®試劑盒么？

不一定。舉例來說，經TwistAmp®基礎試劑盒測試的引物，不能直接用于exo或nfo試劑盒，因為exo和nfo還要把探針納入考慮。另外，跑膠檢測、熒光檢測或側流層析檢測對引物有不同的要求，不能一概而論。DNA檢測和RNA檢測也一般不能共用引物，因為逆轉錄酶和聚合酶有著不同的偏好。

我要怎么選擇探針？

TwistAmp官網上提供有不同檢測探針的設計指南。需要注意的是，TwistAmp® exo探針有一些特殊的限制。TwistAmp® fpg的探針設計更為靈活，但它生成的熒光信號沒有TwistAmp® exo探針強。

使用引物和探針的時候還需要注意些什么？

引物和探針需要同時添加到體系中，一先一后會使片段重組出現偏向性。

生物通編輯：葉予