芯片作為一個成熟的技術(shù)平臺，幾十年來被廣泛用于基因表達(dá)譜的檢測。近年來，二代測序技術(shù)（Next Generation Sequencing , NGS）通過量化整個轉(zhuǎn)錄組上的轉(zhuǎn)錄本reads密度來檢測基因表達(dá)水平，被越來越多的應(yīng)用于基因表達(dá)研究。長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNAs , LncRNAs）是長度超過200nt的非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本。LncRNAs在正常的生理過程和疾病中發(fā)揮重要功能，已成為科學(xué)研究熱點。對于LncRNAs基因表達(dá)譜檢測，芯片技術(shù)比RNA-seq有許多重要且不可替代的優(yōu)勢，仍然是LncRNAs表達(dá)譜檢測的首選平臺（附表），原因有如下幾方面：

• LncRNAs比蛋白編碼RNAs表達(dá)水平低
• RNA-seq對于低豐度轉(zhuǎn)錄本的定量不可靠
• 增加測序深度不能提高低豐度轉(zhuǎn)錄本的檢測準(zhǔn)確度
• RNA-Seq不能精確定量LncRNA與RNA-Seq數(shù)據(jù)分析不成熟密切相關(guān)
• 芯片比RNA-Seq更適合低豐度LncRNAs 表達(dá)譜的檢測

LncRNAs比蛋白編碼RNAs表達(dá)水平低

LncRNAs的一個普遍特征是表達(dá)水平很低[1-5]，LncRNAs的平均表達(dá)水平約為蛋白編碼基因的1/10[4-7] 

*圖釋：LncRNAs（藍(lán)色）和蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本（紅色)在人體組織中的表達(dá)分布[7]。縱軸上的表達(dá)水平以log10RPKM表示。

RNA-seq對于低豐度轉(zhuǎn)錄本的定量不可靠

對于低豐度的RNA，由于測序深度有限造成的泊松抽樣誤差是RNA-Seq誤差的主要來源。因此，低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本不能被RNA-seq可靠檢測，需要進行富集檢測[8]。

在一個包含331M 50bp reads的RNA-Seq數(shù)據(jù)庫（三次技術(shù)重復(fù)）中分析發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)水平與測量精度之間的聯(lián)系[9]。如圖所示，基因表達(dá)水平越高，定量越準(zhǔn)確；反之，基因表達(dá)水平越低，定量的相對誤差越高。由于LncRNAs的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于蛋白編碼基因，絕大部分低豐度的LncRNAs無法通過RNA-seq準(zhǔn)確定量（相對誤差高于20%）。

*圖釋：標(biāo)準(zhǔn)偏差與表達(dá)水平的關(guān)系。Y軸為三次技術(shù)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個灰色點代表一個轉(zhuǎn)錄本。在陰影區(qū)，灰度代表密度，灰度越深，密度越大。如圖中所示，轉(zhuǎn)錄本平均表達(dá)水平越低，標(biāo)準(zhǔn)偏差越高；表達(dá)水平越高，標(biāo)準(zhǔn)偏差越低，定量越可靠，相對誤差低于20%。在RNA-Seq中，只有41%的轉(zhuǎn)錄本能夠被準(zhǔn)確定量（水平虛線以下）；而對于高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本（垂直虛線右側(cè)），其中高達(dá)84%的轉(zhuǎn)錄本的定量是可靠的。這可以從垂直虛線右側(cè)而不是左側(cè)的高密度區(qū)落在了水平虛線以下看出[9]。

增加測序深度不能提高低豐度轉(zhuǎn)錄本的檢測準(zhǔn)確度

增加RNA-Seq測序深度可以提高表達(dá)譜的檢測準(zhǔn)確度。通常，100M reads對于大部分基因和轉(zhuǎn)錄本的檢測是足夠的，但如果要對多數(shù)（72%）基因的表達(dá)水平進行準(zhǔn)確定量則需要500M reads[10]。然而，在對不同豐度的PHB、CD74和BRD4轉(zhuǎn)錄本亞型的研究中發(fā)現(xiàn)，提高測序深度能夠明顯提高高豐度轉(zhuǎn)錄本的檢測準(zhǔn)確度，但是并不能提高低豐度轉(zhuǎn)錄本的檢測準(zhǔn)確度 [10]。

總的來說，無限制的增加測序深度并不能無限的提高低豐度轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平的檢測準(zhǔn)確度。由測序深度增加而提高的準(zhǔn)確度將逐漸趨于飽和[9]。在RNA-Seq數(shù)據(jù)中，僅7%的高豐度轉(zhuǎn)錄本占總測序reads數(shù)的比例高達(dá)75%。增加的數(shù)據(jù)量絕大部分浪費在少量高豐度的轉(zhuǎn)錄本上，例如管家基因。這意味著低豐度LncRNA的表達(dá)水平不僅在通常的測序深度下不能夠準(zhǔn)確檢測，即使盡可能增加測序深度也不能夠?qū)崿F(xiàn)對低豐度LncRNAs的準(zhǔn)確檢測。此外，隨著測序深度的增加RNA樣品中加工不完全的RNA檢出率提高，從而引起LncRNA檢測準(zhǔn)確性的下降。

*圖釋： 定量可靠（誤差低于20%）的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目與測序深度的關(guān)系。X軸的帶括號數(shù)字表示總測序reads數(shù)。額外的內(nèi)部刻度線表示值得測序分析的測序運行數(shù)。右Y軸為所有已知的可被可靠定量的轉(zhuǎn)錄本的比例。小圓圈表示在完整的測序運行中的reads數(shù)（331M reads）。外推的S型曲線表示RNA-Seq能可靠檢測的轉(zhuǎn)錄本最多只能到60%，即使reads數(shù)達(dá)到10bn。

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RNA-Seq不能精確定量LncRNA與RNA-Seq數(shù)據(jù)分析不成熟密切相關(guān)

迄今為止，RNA-Seq數(shù)據(jù)分析方法在外顯子檢測及RNA定量等過程中存在諸多誤差。例如：1）對LncRNA外顯子序列的識別效率低。蛋白編碼基因的外顯子可以通過參考基因組上的翻譯起始位點，終止位點，以及剪切供體和受體位點直接識別，而LncRNA無法通過這些特征位點直接識別。此外，LncRNA的表達(dá)水平比蛋白編碼基因低，即使在相同的覆蓋深度下，檢測的靈敏度也低于蛋白編碼基因2）對LncRNA的組裝精度很低 (下圖)，而且無法通過增加測序深度提高組裝精度。這是由于RNA樣品中含有加工不完全的RNA或是轉(zhuǎn)錄噪音，隨著測序深度的增加它們被測出來的頻率越高，因此隨著測序深度的增加，組裝精度不斷下降。3）定量不準(zhǔn)確。通過比較RNA-Seq與NanoString的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RNA-Seq的定量結(jié)果與NanoString之間相關(guān)性很低（R: 0.34-0.68），而且很多被NanoString檢測到的轉(zhuǎn)錄本通過RNA-Seq無法檢測到。

*圖釋：通過RNA-Seq數(shù)據(jù)進行LncRNA組裝的精度很低。圖中橫軸代表正確組裝的轉(zhuǎn)錄本占已報道的人類轉(zhuǎn)錄本的比例，綠點代表蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本，紅點代表非編碼轉(zhuǎn)錄本（LncRNA）。能被正確組裝的蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本不到已知轉(zhuǎn)錄本的30%，而能被正確組裝的LncRNA比例更低，只有不到20%。

芯片比RNA-Seq更適合低豐度LncRNA 表達(dá)譜的檢測

芯片的原理是通過與序列特異性探針的雜交識別RNA。對于特定的基因，即使雜交體系中存在高豐度的無關(guān)序列也不會影響該基因的雜交結(jié)果，因而對于低豐度表達(dá)譜的檢測幾乎無影響。而RNA-Seq的數(shù)據(jù)中，大部分測序reads被表達(dá)豐度很高的RNA如管家基因占據(jù)，從而導(dǎo)致低豐度的RNA只有很低的覆蓋深度。低覆蓋深度意味著低靈敏度和低可靠性。因此，芯片更適合低豐度RNA的檢測。例如，芯片一般能夠檢測到7000~12,000個 LncRNAs，而RNA-Seq 多達(dá)120M reads也只能夠檢測到1000~4000個 LncRNAs [11]。

雖然RNA-seq可以同時檢測已知和未知的序列，但隨著數(shù)十年的人類表達(dá)序列檢測的數(shù)據(jù)累積，RNA-seq能發(fā)現(xiàn)的新轉(zhuǎn)錄譜越來越少[10]。更多時候，RNA-seq文庫構(gòu)建時產(chǎn)生的人為序列和不成熟的RNA會被誤認(rèn)作新的轉(zhuǎn)錄本。隨著高級的芯片設(shè)計，轉(zhuǎn)錄本亞型可以被芯片上針對外顯子連接點的特異性探針?biāo)鶇^(qū)分。涵蓋絕大多數(shù)已知和最新LncRNA并且能夠特異性檢測轉(zhuǎn)錄本亞型的芯片，由于具有比RNA-Seq更高的靈敏度，仍然是研究者的首選。

附表. Arraystar LncRNA芯片和RNA-Seq對LncRNAs表達(dá)譜檢測的比較

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參考文獻(xiàn)
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