大家都知道，細(xì)胞不斷向細(xì)胞外空間分泌大量的小囊泡、大分子復(fù)合物及小分子。在這些小囊泡中，有一種正受到廣泛的關(guān)注，這就是exosome。exosome的直徑約為30-150 nm。它就像一輛小卡車，運(yùn)載貨物穿梭于身體的不同部位之間。

小卡車上到底裝了什么？大家都想了解。很多年來，人們一直以為只有一些垃圾袋，讓細(xì)胞丟棄不必要的蛋白。然而，如今看來卻并非如此，exosome也攜帶了一些重要的信號分子，如miRNA、ncRNA、mRNA等，至少在某種程度上實現(xiàn)了細(xì)胞間的通訊。因此，小小的exosome似乎有著重要的功能，也有著大大的臨床應(yīng)用前景。

從被遺忘到被重視

exosome的發(fā)現(xiàn)要追溯到30年前。研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)大鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞、綿羊紅細(xì)胞等分泌小囊泡。在分離了這些小囊泡之后，他們發(fā)現(xiàn)了多種有活性的酶。至此，exosome的蛋白運(yùn)輸功能被研究界所接受，然而，之后exosome似乎完全被人遺忘。直到2007年，研究人員發(fā)現(xiàn)了RNA運(yùn)輸功能，exosome才重新成為人們關(guān)注的對象。

exosome不僅由所有培養(yǎng)的細(xì)胞所分泌，還天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。無論是細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的exosome，還是各種器官分泌到體液中的exosome，都參與了細(xì)胞間通訊，或支持或干擾不同的生理過程。

早期的研究發(fā)現(xiàn)，exosome能夠特異靶定受體細(xì)胞，交換蛋白和脂類或引發(fā)下游信號事件。這種小囊泡參與了多個過程：免疫反應(yīng)的促進(jìn)劑、抗原呈遞、程序性細(xì)胞死亡、血管生成、炎癥和凝血等。此外，它還參與了發(fā)育和分化。

不僅如此，這輛小卡車還運(yùn)載了特異的核酸貨物，參與了細(xì)胞間通訊。Valadi等發(fā)現(xiàn)，MC/9和人肥大細(xì)胞系分泌的exosome包含了來自約1300個基因的mRNA以及小RNA，包括121個microRNA。這項成果猶如一枚重磅炸彈，在研究界引起轟動。

于是乎，人們對exosome的興趣激增，從它們在體內(nèi)的功能到更為實際的應(yīng)用 – 診斷和治療方法的開發(fā)。據(jù)統(tǒng)計，目前已有1500多篇有關(guān)exosome的文章發(fā)表，其中大部分是在近3年內(nèi)發(fā)表的，而國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會（ISEV）于去年成立，更是立即吸引了700多名會員加入。

鑒于所有體液中都包含exosome，且其蛋白、RNA和脂肪成分特異，exosome有望在多種疾病的早期診斷中發(fā)揮作用。與傳統(tǒng)的活檢相比，微創(chuàng)（抽血）或無創(chuàng)（使用尿液或唾液）診斷方法減少了患者的痛苦和不便，也降低了分析成本。近兩年，多個研究團(tuán)隊對血液、尿液和唾液中的exosome進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了多種疾病的生物標(biāo)志物，有望指導(dǎo)疾病的個性化治療。

exosome的研究該如何下手

閱讀至此，相信大家都已經(jīng)躍躍欲試了吧。不過，exosome的研究該如何下手呢？首先自然是從細(xì)胞培養(yǎng)基或體液中分離出總exosome，亞群的分離檢測；接著是回收里面的RNA或者蛋白質(zhì)貨物；再通過qRT-PCR等方法進(jìn)行深入的功能分析。新的研究方向雖容易發(fā)表文章，也面臨著更大的挑戰(zhàn)，因為研究方法還不成熟，市售工具相當(dāng)少，可能需要花費(fèi)大量時間去開山辟路優(yōu)化方法。生物通在這里為您推薦一系列全新的標(biāo)準(zhǔn)化研究工具，讓您可以將更多精力專注于exosome通路和生物學(xué)功能的研究上。

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exosome的分離

早前發(fā)表的一些研究主要是從淋巴細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞以及血清、唾液和母乳中提取出exosome并回收RNA，再利用qRT-PCR和新一代測序來進(jìn)行鑒定和分析。它們在分離時往往是采用超速離心的方法。這的確是一種經(jīng)典的方法，能制備出干凈的exosome。但是，缺點也不少：耗時耗力，往往需要8-30個小時；每次最多只能處理6個樣品；需要大量的起始材料；產(chǎn)量不高。最重要的是，你得有臺超速離心機(jī)，還要有豐富的經(jīng)驗。

如果有個試劑盒，像提質(zhì)粒那樣輕松地提取出exosome，那就再好不過了。幸好，這樣的試劑盒已經(jīng)上市。Life Technologies公司旗下Invitrogen品牌推出了多款總exosome提取試劑盒，能分別從細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、血漿、尿液及其他體液中分離完整的exosome。與超速離心相比，這種方法實在是簡單省事多了。

這種試劑通過捆綁水分子，將溶解度不太高的組分（如囊泡）擠出溶液，從而可通過常規(guī)離心來收集。樣品先經(jīng)過2000xg 30分鐘低速離心以去除細(xì)胞碎片，根據(jù)樣品類型加入指定比例的提取試劑并混勻，并在2-8°C孵育一定時間（血清樣品只需4度孵育30分鐘，培養(yǎng)基上清則需孵育過夜），然后通過常規(guī)離心（10,000 x g，10-60分鐘，因樣品類型而異）即可回收exosome沉淀。其中手動操作部分僅需15-20分鐘，甚至比提質(zhì)粒還簡單。之后用PBS或類似溶液重新溶解沉淀。這下，exosome可立即用于下游分析或進(jìn)一步的純化啦。

Life Tech的平行比較試驗結(jié)果顯示，試劑法與超速離心法提取出的exosome相當(dāng)。在NanoSight® LM10儀器上分析的圖譜顯示，所有囊泡均小于300 nm，且大部分處于exosome的典型大小范圍30-150 nm（圖1）。

圖1. 從HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基中回收的Exosome的分析。(A) 采用總Exosome提取（從細(xì)胞培養(yǎng)基中）回收的Exosome的大小分布與 (B) 采用傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度超速離心實驗方案提取的Exosome相當(dāng)。

分離亞群

在獲得了總的exosome之后，您還可以通過磁珠提取出高純度的亞群。例如Dynabeads®磁珠可捕獲表達(dá)CD63的exosome，用于下游的流式細(xì)胞儀、電鏡或Western blotting分析。超順磁的Dynabeads呈淺棕色，因此在整個操作過程中您都可以“查看”您的樣品。此外，樣品量和磁珠量也能輕松調(diào)整。當(dāng)然，您也可以不選CD63，而通過生物素化的抗體和鏈霉親和素試劑來富集您感興趣的亞群。

完整exosome的分析

分離過程結(jié)束后，您可能想要觀察和確認(rèn)一下這些小囊泡。不過，exosome的觀察還真不簡單，因為它們太小了。目前，研究人員多借助以下工具和方法。

在收集到exosome之后，我們可利用NanoSight® 儀器來分析囊泡的大小范圍和濃度。這款儀器根據(jù)Stokes-Einstein 原理，將每一個進(jìn)行布朗運(yùn)動的顆粒直徑計算出來。它既提供直接實時的納米顆粒觀察，也給出全面的顆粒粒徑分布分析。

若沒有NanoSight，那也沒關(guān)系。通過RNA或膜組分的標(biāo)記，我們也能在顯微鏡下觀察exosome。Life Tech還提供了專門的Exosome離心柱（MW 3000），能夠快速去除未摻入的染料。同時，這些離心柱也能用于緩沖液交換，或去除低分子量的雜質(zhì)，如鹽、核苷酸和小的寡核苷酸。此外，經(jīng)過Dynabeads®磁珠富集的亞群可直接用于電鏡和流式細(xì)胞儀（圖2）。

圖2. 利用流式細(xì)胞儀觀察CD63+ Exosome。Exosome結(jié)合至包被有CD63（A和B）的乳膠微球或包被有生物素化的CD63（C和D）的Dynabeads® 鏈霉親和素上，并進(jìn)行CD63-PE染色。FSC/SSC (1,500次)和熒光直方圖如圖所示。

exosome貨物的分離與分析

核酸與蛋白的分析對于許多研究人員來說已經(jīng)是駕輕就熟了。Life Tech的總Exosome RNA和蛋白分離試劑盒能夠從同一樣品中分離蛋白和總RNA。試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化操作為實驗帶來可重復(fù)的結(jié)果。此外，您也可以通過Exosome免疫沉淀試劑盒，借助Dynabeads®磁分離技術(shù)來溫和地分離出完整的exosome蛋白復(fù)合物。

這之后，就等你大顯身手了。無論是利用Western blot來分析exosome蛋白，或是利用qRT-PCR或RNA-seq來分析RNA，exosome這種信號傳導(dǎo)的新途徑無疑將為您揭開一個新的研究篇章。

exosome這些迷人的小卡車，每天兢兢業(yè)業(yè)地在細(xì)胞之間穿梭，傳遞著重要的訊息。盡管這還是個年輕的研究領(lǐng)域，但有了不斷上市的新工具，相信我們對exosome的了解會更加深入，更多exosome的秘密將會揭開。

如果您有興趣了解exosome研究方面的最新進(jìn)展，歡迎加入Life Tech的在線培訓(xùn)資源。您也可以登陸exosome的技術(shù)論壇：Exosomestalk（http://exosomestalk.com/），交流exosome相關(guān)的信息，提交自己的疑問。Life Tech的“exosome之家”頁面也列出了所有相關(guān)產(chǎn)品信息，供您查看。（生物通 余亮）

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參考文獻(xiàn)

1. Vlassov AV, Magdaleno S, Setterquist R, Conrad R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 2012 Jul;1820(7):940-8.

2. Zeringer E, Li M, Barta T, et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 2013 March 26; 3(1): 11-18.