單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)

NanoString Technologies的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞群體的RNA平均表達(dá)水平不一定與群體中單個細(xì)胞的RNA表達(dá)相同。例如，有些基因持續(xù)在低水平表達(dá)，而另一些則在短時間內(nèi)大量表達(dá)。對宏觀測定而言，這樣的表達(dá)模式被平均化。

該公司獨特的數(shù)字表達(dá)譜分析系統(tǒng)能直接對單個RNA分析進(jìn)行計數(shù)，最多可分析單細(xì)胞中的800個不同分子。這是利用nCounter Single Cell Gene Expression Assay中的分子條形碼來實現(xiàn)的，它識別特定的RNA分子。單細(xì)胞樣品在裂解后，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴(kuò)增，隨后與分子條形碼雜交，純化后在nCounter®分析儀上讀取。

哈佛大學(xué)的Hongkun Park研究小組與Broad研究院的Aviv Regev研究小組合作，來研究看似均質(zhì)細(xì)胞中的基因表達(dá)異質(zhì)性¹。Park、Regev及其同事利用一種稱為Smart-Seq的技術(shù)，來讀取RNA轉(zhuǎn)錄本的覆蓋。與原先的RNA-Seq方法相比，Smart-Seq讓研究人員能夠更詳細(xì)了解mRNA選擇性剪接所產(chǎn)生的異構(gòu)體，同時更好地鑒定單核苷酸多態(tài)性（SNP）。

通過計算機(jī)分析，Regev和Park發(fā)現(xiàn)，mRNA豐度和剪接模式都存在之前未觀察到的雙峰（bimodal）變化，并通過RNA-熒光原位雜交（FISH）對精選轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了驗證。如今，他們正在擴(kuò)展樣品類型。Park談道：“目前我們正將單細(xì)胞RNA-Seq方法應(yīng)用在各種免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和癌癥細(xì)胞上，以便了解驅(qū)動細(xì)胞之間變化的因素、這種變化的動力學(xué)及其生物學(xué)影響。”

Regev和Park的團(tuán)隊也在探索另一種新技術(shù)，最初由斯坦福大學(xué)Garry Nolan實驗室開發(fā)的CyTOF Mass Cytometry。這種方法結(jié)合了質(zhì)譜和流式細(xì)胞術(shù)，讓研究人員能夠分析單細(xì)胞所表達(dá)的幾十種不同的mRNA或蛋白質(zhì)。CyTOF由DVS Sciences公司推出，曾被The Scientists雜志評為2011年十大創(chuàng)新技術(shù)之一。

RNA測序領(lǐng)域的另一項進(jìn)展是RNA-capture-seq，在測序之前用Tiling芯片來放大轉(zhuǎn)錄組的一部分。這樣能帶來更好的分辨率，并且只關(guān)注感興趣的區(qū)域。安捷倫科技公司提供這種目標(biāo)捕獲的工具，Illumina和羅氏NimbleGen也有。

安捷倫的高級產(chǎn)品經(jīng)理Anniek De Witte認(rèn)為，目標(biāo)富集策略，如RNA-capture-seq，特別適合臨床研究應(yīng)用，其中細(xì)胞極其稀少，如循環(huán)腫瘤細(xì)胞，或胚胎活檢的單細(xì)胞。研究人員也會對異質(zhì)的腫瘤樣本感興趣，因為每次研究一個細(xì)胞非常重要。

高內(nèi)涵成像

隨著成像系統(tǒng)的分辨率以及試劑的不斷改善，顯微鏡專家也開始將他們的注意力轉(zhuǎn)移到單個細(xì)胞。賽默飛世爾科技為單細(xì)胞和細(xì)胞群體的高內(nèi)涵成像和分析提供了工具。他們的儀器有Thermo Scientific™ ArrayScan™和CellInsight™高內(nèi)涵成像儀；他們也為高內(nèi)涵成像時的多重分析提供試劑和抗體。

高內(nèi)涵，意味著從單個細(xì)胞中提取大量信息。因此，賽默飛世爾的儀器都配備了靈敏的檢測器，尤其適合那些昏暗的樣品，或者活細(xì)胞樣品，為了減少光毒性作用而不得不采用弱光。其中一個例子就是ArrayScan Infinity高內(nèi)涵平臺，它的共聚焦模塊特有增強(qiáng)分辨率的功能，如高速Nipkow轉(zhuǎn)盤技術(shù)和可變針孔（pin-hole），可精確控制目標(biāo)內(nèi)的圖像獲取。

高內(nèi)涵分析過去主要在制藥研究中開展，而如今也漸漸普及到科研機(jī)構(gòu)。通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部細(xì)胞技術(shù)方面的首席科學(xué)家Nick Thomas也看到了科研和制藥機(jī)構(gòu)之間的需求轉(zhuǎn)變。該公司的高內(nèi)涵篩選儀器IN Cell Analyzer過去主要用在制藥公司，但在最近幾年，客戶基礎(chǔ)發(fā)生了一些改變。據(jù)介紹，相當(dāng)一部分的儀器及組件是出售給了科研機(jī)構(gòu)。

隨著這種轉(zhuǎn)變，通用電氣也在積極響應(yīng)，不斷開發(fā)新的試劑和軟件。他們的研發(fā)小組曾改造了帶GFP融合蛋白的細(xì)胞，以作為探針。據(jù)Thomas介紹，這些GFP探針相當(dāng)靈敏，可用于查看細(xì)胞的細(xì)節(jié)，如細(xì)胞周期的變化。“這些工具的開發(fā)補(bǔ)充了儀器的力量，”他補(bǔ)充道。

研發(fā)小組的另一個方向是讓藥物開發(fā)人員和科研人員能夠了解單個細(xì)胞隨時間的變化。許多藥物作用于線粒體，這對于心臟細(xì)胞或肝細(xì)胞而言可能損害較大。這兩個器官都有著很高的能量要求，需要帶許多線粒體的細(xì)胞。Thomas認(rèn)為，線粒體是高內(nèi)涵成像的一個理想目標(biāo)，讓研究人員能夠在較大的藥物濃度范圍或較長的治療時間內(nèi)觀察線粒體的形態(tài)或完整性。

GE有兩種IN Cell型號。一個帶有CCD照相機(jī)及500萬像素的成像芯片。它讓用戶能夠在低倍物鏡下觀察廣泛的區(qū)域，從而讓每幅圖像中的細(xì)胞數(shù)量最大化。Thomas表示：“由于用的是高像素照相機(jī)，您仍有足夠的分辨率來進(jìn)行圖像分析。”另一個型號則用的是CMOS照相機(jī)。再結(jié)合以激光為光源的可變光闌線掃描，滿足了共聚焦成像的需求。此外，實驗中每個熒光通道的成像從寬場到共聚焦范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，讓用戶可以充分控制成像速度和圖像質(zhì)量。

Thomas認(rèn)為，這樣的安排能夠讓研究人員更高效地開展實驗。舉個例子，一位研究人員正在開展四色分析，僅僅一個通道需要共聚焦，以便詳細(xì)觀察線粒體。那么，共聚焦可限制在紅色通道，而藍(lán)色、綠色和橙色通道關(guān)閉。這樣，他就能節(jié)省大量的時間。有了這臺儀器，用戶只在需要的時候共聚焦，而不會讓成像速度受到影響。Thomas相信這一靈活的功能讓IN Cell Analyzer 6000與眾不同。

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真的從一個細(xì)胞中獲得DNA和RNA數(shù)據(jù)？這雖然有難度，但隨著各種技術(shù)的不斷發(fā)展，相信這一夢想將會很快實現(xiàn)。（生物通 余亮）

參考文獻(xiàn)

1. Shalek, AK, Satija, R, Adiconis, X, Gertner, RS, Gaublomme, JT, Raychowdhury, R, Schwartz, S, Yosef, N, Malboeuf, C, Lu, D, Trombetta, JJ, Gennert, D, Gnirke, A, Goren, A, Hacohen, N, Levin, JZ, Park, H, Regev, A, “Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells,” Nature, 498(7453):236-240, 2013.

延伸閱讀

單細(xì)胞分析之全攻略（上）