生物通報道：新一代測序技術在爆炸式發展的同時，也衍生出許多其他技術創新。RNA深度測序（RNA-Seq）就是其中之一，這項技術使我們對細胞發育及其調控機制的理解，達到了前所未有的深度和廣度。盡管研究細胞RNA并不是什么新鮮事，但RNA-Seq的出現大大拓展了轉錄組研究的規模，取得了累累碩果，這些是傳統技術難以企及的。

轉錄組通常是指一個細胞中的所有轉錄本，特定發育階段或生理條件下的轉錄本可以揭示許多寶貴的生物學信息。轉錄組學研究可以對細胞/組織的全部/部分轉錄組進行分析。例如，分析細胞的RNA組成并加以注釋（包括編碼和非編碼的轉錄本）；檢測基因結構（外顯子/內含子邊界、轉錄啟示位點、剪切模式、基因融合事件等等）；幫助人們定位基因互作網絡等等。不過目前最普遍的應用是，通過轉錄組研究來確定不同條件下轉錄本表達模式的改變，尋找并驗證新生物學指標。

芯片

自二十世紀九十年代中期以來，芯片就是進行高通量基因組表達分析的中堅力量。這一過程包括：抽提RNA、反轉錄為cDNA、擴增、熒光標記和片斷化。這些cDNA克隆隨后被用于芯片檢測，芯片上布滿了相應的DNA探針。

芯片上的探針可以代表生物整個基因組或部分基因組，例如外顯子、miRNA或單核苷酸多態性SNP等等。芯片上各點的信號強弱，代表了該探針目的基因（蛋白）的表達量。“這一切以雜交為中心，是一種高靈敏高特異性的途徑。芯片檢測的結果很容易釋讀，誤差很小，” 美國國家兒童醫療中心的遺傳醫學研究中心主任Eric Hoffman說。

為了尋找影響Duchenne型肌營養不良癥的調節子，Hoffman設計并訂制了一個芯片�！拔覀兺ㄟ^這一芯片，可以專注于分析改變了蛋白質的多態性，從而縮小范圍，使結果更易于解讀，”他解釋道。

芯片技術的最大局限是，構建芯片需要已知的基因組信息。對于基因數據庫中沒有的非編碼RNA和未測序生物的RNA，就無法用芯片技術來檢測其轉錄情況�？梢姡�芯片技術并不是探索未知領域的理想工具。此外，芯片檢測的動態范圍較窄，這意味著你往往必須在高豐度轉錄本和低豐度轉錄本中做出選擇，而罕見轉錄本的檢測并不容易。除非進行特殊設計，一般芯片無法鑒別剪切突變或等位基因特異性突變。而且由于存在交叉反應，用芯片法檢測高度相關的RNA種類也并不理想。

RNA-Seq

上述問題在RNA-Seq技術出現后，得到了極大改善。RNA-Seq技術可對樣本中所有轉錄本進行多重測序，不論是否存在參考基因組，都可以獲得精確到堿基的整個轉錄組。隨著測序技術的成本持續走低，RNA-Seq正迅速成為研究基因組表達情況的首選途徑。該技術能夠呈現五個數量級的表達水平差異，還能檢測外顯子、等位基因突變以及非編碼RNA等等。

不同RNA-Seq平臺的讀取長度不同，從36bp到400bp不等。不論是否存在參考基因組，這這些讀段都可以通過軟件定位，重新構成全長的轉錄本。

通過RNA-Seq實驗可以獲得相當驚人的數據量，而這恰恰是一柄雙刃劍。豐富的數據量蘊含著大量的寶貴信息，但這樣的數據需要進行復雜而耗時的生物信息學分析，才能從中提取到有意義的結果。因此，人們往往會在實驗中進行一些預處理，以簡化數據釋讀，例如事先挑選或去除poly-A RNA。盡管如此，RNA-Seq所生成的數據仍然比芯片要多上幾個數量級。

“許多RNA測序研究都在實驗設計和結果釋讀上遇到了麻煩，” Hoffman警告說。“RNA-Seq生成的數據量更大，靈敏度更高，動態范圍更廣，但這并不等于你的問題就一定能得到順利解決�！�

（Josh P. Roberts撰寫/生物通編譯）

參考文獻：

RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics

http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n1/abs/nrg2484.html

RNA-Seq is a recently developed approach to transcriptome profiling that uses deep-sequencing technologies. Studies using this method have already altered our view of the extent and complexity of eukaryotic transcriptomes. RNA-Seq also provides a far more precise measurement of levels of transcripts and their isoforms than other methods. This article describes the RNA-Seq approach, the challenges associated with its application, and the advances made so far in characterizing several eukaryote transcriptomes.