在定量PCR時，我們常常糾結(jié)一個問題，究竟是相對定量還是絕對定量呢？如今，你無需糾結(jié)了，因?yàn)閿?shù)字PCR（digital PCR或dPCR）來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似，都是估計(jì)起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來測定核酸量，而dPCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的絕對定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）、二代測序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。

數(shù)字PCR技術(shù)，是通過將微量樣品作大倍數(shù)稀釋和分液（partitioning），直至每個樣品中所含有的待測分子數(shù)不會超過1個，再將所有樣品在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)的樣品逐個進(jìn)行計(jì)數(shù)的一種技術(shù)。

圖片來自Life Technologies

它是一種絕對測量方法，因?yàn)樵谶@種條件下，只有含有1個目標(biāo)分子的樣品才能被不斷放大至幾百萬倍的程度，其所產(chǎn)生的信號（例如熒光）將會非常強(qiáng)，以致可通過數(shù)個數(shù)的辦法進(jìn)行絕對測量，其他樣品即使含有會產(chǎn)生干擾信號的雜質(zhì)分子，但是由于雜質(zhì)分子不可能發(fā)生PCR擴(kuò)增，因此其信號將不可能達(dá)到能影響最終檢測結(jié)果的程度。

數(shù)字PCR的概念其實(shí)早在1999年就由Vogelstein和Kinzler提出，其初衷是為了能夠從大量的正常細(xì)胞中檢測出突變細(xì)胞，但由于當(dāng)時能用于稀釋樣品的耗材只是384孔板，因此還不能非常好地體現(xiàn)數(shù)字PCR的優(yōu)勢。

2006年，美國Fluidigm公司開發(fā)出第一臺商業(yè)化的數(shù)字PCR系統(tǒng)，它是基于集成流體通路（IFC）芯片。2010年，Life Technologies也推出了數(shù)字PCR產(chǎn)品線 – OpenArray系統(tǒng)。之后，QuantaLife公司開發(fā)出微滴數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)，并因此獲得2011年度Frost & Sullivan北美新產(chǎn)品創(chuàng)新獎。2011年10月，Bio-Rad公司收購了QuantaLife和ddPCR技術(shù)，推出了QX100微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)。

Fluidigm與IFC芯片

Fluidigm公司結(jié)合微流體技術(shù)，生物技術(shù)和微電子等技術(shù)，于2006年底推出了Bio-Mark™ 高通量基因分析系統(tǒng)。其創(chuàng)新就在于集成液體通路技術(shù)：利用集成電路制作工藝（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，通過不同的控制閥門控制溶液在其中的流動來實(shí)現(xiàn)生物樣品的分液、混合、PCR擴(kuò)增。集成流體通路技術(shù)極大地簡化了生物樣品和試劑的分液操作，提高分析通量和靈敏度，其納升級的反應(yīng)體系為高通量的基因分析應(yīng)用節(jié)省大量成本（試劑用量更少，樣品量更少）。

Bio-Mark™基因分析系統(tǒng)由Bio-Mark™實(shí)時PCR系統(tǒng)（整合了高性能計(jì)算機(jī)）、IFC微液流芯片（耗材）、IFC Controller（將生物樣品、反應(yīng)試劑導(dǎo)入到IFC微液流芯片中）和數(shù)據(jù)分析軟件四部分構(gòu)成。IFC微液流芯片有2種：Dynamic Array（48.48動態(tài)芯片和96.96動態(tài)芯片）和Digital Array（12.765數(shù)字芯片和48.770數(shù)字芯片），應(yīng)用于不同的基因分析中：拷貝數(shù)變化分析、遺傳突變檢測、基因分型、基因定量、單細(xì)胞基因表達(dá)等。

數(shù)字芯片將預(yù)混液（樣品與PCR試劑）分成數(shù)百個單獨(dú)的PCR反應(yīng)，開展數(shù)字PCR分析。整個過程分為五步：準(zhǔn)備芯片；將每個樣品預(yù)混液移液至芯片的獨(dú)立入口；將芯片放入IFC Controller，利用軟件界面迫使分析組分進(jìn)入單獨(dú)的反應(yīng)板；將芯片放入BioMark系統(tǒng)，開展熱循環(huán)和熒光檢測；利用分析軟件來查看和分析擴(kuò)增曲線。

Fluidigm公司分子生物學(xué)主管Ramesh Ramakrishnan認(rèn)為，數(shù)字PCR的流程顯然比傳統(tǒng)的qPCR更簡單，但通量較低。然而，數(shù)字PCR更特異，特別是在搜索稀有突變時。拷貝數(shù)變異分析就是一個很好的例子。采用12.765數(shù)字芯片，通過數(shù)字PCR，每個反應(yīng)體系用量僅6 nL，可有效分辨12 與13 倍（或更高）的差異。

Fluidigm如今正努力讓微流體芯片變得更靈活，包括每個芯片的樣品量和每個樣品的分液數(shù)量。Ramakrishnan表示：“目前我們每塊芯片上能夠開展最多48個不同樣品的數(shù)字PCR，且每個樣品能夠分成770個單獨(dú)的反應(yīng)倉。我們正在探索新的芯片形式，以便更改每塊芯片的樣品數(shù)量以及每個樣品的反應(yīng)倉數(shù)量。”（未完，待續(xù)）

（生物通 余亮）