蛋白質(zhì)組的研究不僅能為生命活動(dòng)規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為眾多種疾病機(jī)理的闡明及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑。由于基因表達(dá)往往是通過(guò)基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)產(chǎn)生一個(gè)蛋白質(zhì)前體，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行加工、修飾，才成為一個(gè)具有生物活性的蛋白質(zhì)，所以同樣的一個(gè)基因在不同條件、不同時(shí)間和空間可能不只有一種相應(yīng)的蛋白質(zhì)，可能會(huì)有幾種，甚至幾十種對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)存在。正是蛋白質(zhì)樣品的這種高復(fù)雜度和不同蛋白濃度的高差異性，使蛋白質(zhì)組學(xué)研究面臨著挑戰(zhàn)。

所以，如果能有一種技術(shù)，顯著降低蛋白質(zhì)樣品的復(fù)雜程度，將大大提高蛋白質(zhì)組學(xué)研究的效率。而Agilent 3100 OFFGEL等電聚焦分離儀正是這樣一款儀器，它能顯著降低蛋白質(zhì)樣品復(fù)雜度，提高后續(xù)分析的靈敏度及分辨率。

3100 OFFGEL的技術(shù)原理

基于等電點(diǎn)在液相環(huán)境下分級(jí)分離蛋白質(zhì)或多肽，即蛋白或多肽樣品置于IPG（固化PH梯度）膠條上方間隔中（內(nèi)含緩沖液），在電場(chǎng)作用下，樣品在IPG膠條中遷移，逐步等電分離，*終樣品保留在上層緩沖液中，可方便的取樣進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

如圖，實(shí)驗(yàn)之前，蛋白或多肽樣品直接加到緩沖液中，免去了樣品溶入IPG膠條的步驟；
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，樣品保留在溶液中，避免了割膠回收的步驟。

Agilent 3100 OFFGEL的主要作用

在蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中，Agilent 3100 OFFGEL主要用于對(duì)蛋白樣品進(jìn)行基于等電點(diǎn)的預(yù)分離，顯著降低蛋白樣品的復(fù)雜度，提高下游檢測(cè)的靈敏度。蛋白組學(xué)研究的三大支撐技術(shù)：雙向電泳、質(zhì)譜和計(jì)算機(jī)圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)，后兩種技術(shù)都可以和Agilent 3100 OFFGEL配合使用，對(duì)樣品實(shí)現(xiàn)預(yù)分離。根據(jù)所用試劑盒可達(dá)到pH 0.1–0.6的分辨率，而且溶液中的分離成分回收，方便了LC/MS分析。

3100 OFFGEL如何配合LC-MS/MS使用？

一般的LC/MS工作流程是:生物樣品（細(xì)胞、血漿、血清、體液等）裂解——蛋白提取——胰酶消化成肽段（根據(jù)需要進(jìn)行凍干、用甲酸重溶解、純化等步驟）——3100 OFFGEL（約20h）——液相回收多肽——脫鹽——凍干——用甲酸重溶解——上LC-MS——獲得的肽段與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，鑒定肽段（注：1. 蛋白提取后，可以不用胰酶消化，直接上樣，相對(duì)肽段樣品來(lái)說(shuō)回收率低，靈敏度也低；2. 在凍干前是否需要脫鹽取決于LC-MS是否有在線脫鹽功能）。

3100 OFFGEL的優(yōu)勢(shì)有哪些？

1、3100 OFFGEL 可以顯著提高M(jìn)S分析的蛋白檢出率

使用OFFGEL分離后，質(zhì)譜檢測(cè)出蛋白數(shù)是先前的4倍

2、3100 OFFGEL 的蛋白或多肽分離結(jié)果具有極好的重復(fù)性

 
同一樣品用OFFGEL進(jìn)行3次分離，跑SDS-Page驗(yàn)證OFFGEL分離的重現(xiàn)性

3、3100 OFFGEL的分離結(jié)果具有極高的分辨率

3100 OFFGEL的技術(shù)特點(diǎn)

• 基于PI的游離膠 預(yù)分餾，根據(jù)所用試劑盒可達(dá)到pH 0.1–0.6的分辨率
• 溶液中的分離成分回收，方便了LC/MS分析
• 兩個(gè)電源設(shè)置允許同時(shí)分離兩組濃度相差很大的樣品
• 一次可同時(shí)分餾多達(dá)16個(gè)樣品
• OFFGEL（游離膠）或INGEL（傳統(tǒng)IEF）兩種模式可選
• 寬范圍上樣量：50 μg ~ 5 mg
• 高回收率：蛋白＞70%，多肽＞80%
• 開(kāi)放耗材：多種 IPG-strips可供選擇
• 可進(jìn)行實(shí)時(shí)“診斷”：通過(guò)觀察電流變化判斷樣本的分離情況
• 簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、容易使用
• 整合性：可以兼容多個(gè)系統(tǒng)完成一系列工作，例如整合MARS, LC/MS, mRP以及生物分析儀等