生物通報(bào)道 你說(shuō)世界變化快不快，PCR已經(jīng)邁入第三代！近日，一種稱為微滴式數(shù)字PCR（ddPCR™）的新技術(shù)出現(xiàn)在《Analytical Chemistry》雜志上，它能夠確定樣品中待測(cè)靶分子的絕對(duì)數(shù)目。

第一代PCR就是我們目前最常用的終點(diǎn)PCR技術(shù)，通過(guò)凝膠電泳獲得定性的結(jié)果。風(fēng)靡全球的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)為第二代，它利用熒光試劑監(jiān)控?cái)U(kuò)增，來(lái)實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量。在開(kāi)展基因表達(dá)分析時(shí)，需要標(biāo)準(zhǔn)曲線或參考基因來(lái)協(xié)助定量。

微滴式數(shù)字PCR則為第三代PCR，它不再依賴Cq值或內(nèi)參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對(duì)數(shù)目。微滴技術(shù)讓數(shù)字PCR更低成本，且更實(shí)用。

文章的第一作者為Bio-Rad公司的Ben Hindson博士。Bio-Rad公司在不久前推出了QX100™ 微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)，帶來(lái)了ddPCR技術(shù)。此系統(tǒng)能夠確定核酸分子的絕對(duì)數(shù)目，讓研究人員無(wú)比精確地研究生物學(xué)。Hindson博士表示，ddPCR克服了之前數(shù)字PCR系統(tǒng)的缺陷，如成本高、通量有限且流程復(fù)雜。

QX100 微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為1，沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。

這篇新發(fā)表的文章證明了QX100微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)在三個(gè)方面的作用：拷貝數(shù)變異（CNV）研究、稀有等位基因檢測(cè)和血漿DNA定量。

對(duì)于CNV研究，大量的微滴提供了足夠的精確度，能準(zhǔn)確測(cè)定拷貝數(shù)狀態(tài)。利用QX100微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)來(lái)篩查HapMap樣品的CNV，拷貝數(shù)狀態(tài)可完全分辨。

對(duì)于稀有等位基因的檢測(cè)，將突變DNA與高度同源的野生型DNA分開(kāi)，提高了靈敏度。有了QX100系統(tǒng)，研究人員能夠檢測(cè)BRAF V600E中低至0.001%的突變片段，與定量PCR相比，靈敏度提高1000倍。

最后，研究人員還利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)準(zhǔn)確檢測(cè)了孕婦血漿中高度片段化的DNA。這種方法有望發(fā)展成無(wú)創(chuàng)的產(chǎn)前診斷技術(shù)，因此現(xiàn)在也很熱門(mén)。

作者認(rèn)為，此系統(tǒng)能夠協(xié)助研究人員探索復(fù)雜的遺傳圖像，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證新的疾病關(guān)聯(lián)，并定義分子診斷的新時(shí)代。（生物通 薄荷）

原文摘要

High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number

Anal. Chem., 2011, 83 (22), pp 8604–8610

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