（生物通專稿）microRNA（miRNA）是一類天然存在的非編碼RNA，在基因調(diào)控中扮演著重要角色。它們是高度保守的單鏈RNA（~22個核苷酸），從更長的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體轉(zhuǎn)錄本中剪切而來。到目前為止已經(jīng)報(bào)道了800多個人類miRNA，還有更多的在等待實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。一系列研究表明miRNA參與了許多細(xì)胞內(nèi)的過程，包括發(fā)育、分化、增殖、凋亡等，那么它們自然也與癌癥發(fā)育息息相關(guān)。

為了鑒定分化表達(dá)的miRNA，許多研究都以整體的miRNA表達(dá)圖譜作為起始。目前進(jìn)行miRNA圖譜分析的主要方法之一是利用miRNA芯片，一次實(shí)驗(yàn)即可在整體全局角度上同時檢測多個miRNA的表達(dá)情況和相互關(guān)系。

可是，事情并非如此簡單。miRNA研在生理功能上如此重要，在過去卻一直不為人知的原因，很大程度是由于其分子小，風(fēng)度低，不穩(wěn)定，種類多，同源程度高，等等。僅僅22nt左右大小的單鏈RNA分子，極低的豐度，純化難度可想而知，特別是在樣品量有限的情況下。由于分子小而導(dǎo)致難以擴(kuò)增，更增加了微量樣品的分析困難，特別是高通量對大量樣品進(jìn)行分析----幾乎成為Mission Impossible----不可能完成的任務(wù)。

鎖定miRNA目標(biāo)的定量分析也好，miRNA芯片也好，對樣品量有一定的要求----以芯片為例，通常需要1微克以上的RNA，有的甚至需要10微克。而對于只有幾個-到數(shù)百個細(xì)胞的樣品來說，無法擴(kuò)增的情況下芯片就有些束手無策了。

在此，生物通介紹一種miRNA圖譜分析的新方法，既能準(zhǔn)確定量miRNA，樣品量又無需那么多。ABI的TaqMan MicroRNA Arrays和我們常規(guī)說的芯片其實(shí)不同，這種芯片更像是TaqMan MicroRNA Assay的芯片集成形式----通過對分析方法的創(chuàng)新改造，將TaqMan分析和實(shí)時定量PCR的特異性、靈敏度和重復(fù)性金標(biāo)準(zhǔn)引入到miRNA的檢測和定量中。

我們首先來看看TaqMan MicroRNA Assay----其實(shí)就是RT-qPCR----它利用反轉(zhuǎn)錄和定量PCR來定量miRNA的表達(dá)。可是，要知道，僅僅22nt的RNA短序列模板可不是一般的反轉(zhuǎn)錄可以做到的，其設(shè)計(jì)的巧妙創(chuàng)新之處在于Megaplex反轉(zhuǎn)錄中的引物并非隨機(jī)引物，而是靶特異的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物。這個創(chuàng)新設(shè)計(jì)解決了miRNA定量中的基本問題：成熟miRNA的短序列（~22nt）不允許在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用傳統(tǒng)的隨機(jī)引物。莖環(huán)結(jié)構(gòu)提供了僅針對成熟miRNA模板的特異性，并形成引物/成熟miRNA嵌合體從miRNA的3’端開始延伸。產(chǎn)生的較長反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物能作為模板，用于標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)時定量PCR分析。就這樣，miRNA就可以被擴(kuò)增了----一旦擴(kuò)增問題解決，樣品量小，低豐度等等問題自然也迎刃而解，miRNA的定量檢測和圖譜分析也就有邁出了關(guān)鍵的第一步。

道理雖簡單，但這也不是你能自己合成的引物。所以只能去ABI購買。Megaplex Primer Pools提供了Sanger MiRBase v10的綜合覆蓋度，覆蓋人、小鼠或大鼠的667、518或303個miRNA。能滿足已知miRNA圖譜分析的需求。如果你的研究目標(biāo)恰在其中，那么恭喜，后面的工作就相當(dāng)順理成章了。

因?yàn)橛辛藬U(kuò)增，TaqMan MicroRNA Assay就顯得更加靈敏。研究人員只需要極少量的總RNA樣品即可。DNA預(yù)擴(kuò)增步驟的引進(jìn)更顯著降低了起始RNA樣品量。即使1ng的總RNA，也能產(chǎn)生綜合的表達(dá)圖譜（Reference 1)。這樣1個細(xì)胞也能進(jìn)行分析，對臨床樣品而言絕對是個利好消息。而傳統(tǒng)的方法至少需要幾百納克總RNA。

對于這種創(chuàng)新的擴(kuò)增方法，實(shí)驗(yàn)表明是可靠的----TaqMan Assay的線性動態(tài)范圍也很廣，你可以得到多達(dá)7個對數(shù)級的線性動態(tài)范圍。從幾個拷貝到幾百萬個拷貝的microRNA靶點(diǎn)都可以在同一實(shí)驗(yàn)中準(zhǔn)確定量。鑒于miRNA的濃度在不同的細(xì)胞、組織類型和疾病狀態(tài)時差異很大，這可是一個相當(dāng)關(guān)鍵的因素。

作為PCR和熒光定量探針TaqMan-MGB技術(shù)的權(quán)威品牌之一（Roche公司為TaqMan專利持有人），ABI開發(fā)的TaqMan-MGB產(chǎn)品一直被視為金標(biāo)準(zhǔn)，因此不難想象，ABI的此類產(chǎn)品都會不由自主的向金標(biāo)準(zhǔn)靠攏。需時三個小時得到結(jié)果。整體的miRNA圖譜可以在5小時內(nèi)產(chǎn)生，不需要幾天。

有了前面的鋪墊，生物通在這里進(jìn)一步介紹TaqMan Assay的芯片形式-TaqMan MicroRNA Arrays。它將TaqMan MicroRNA Assays的所有優(yōu)勢集合并預(yù)裝成便利的微流體芯片形式，特別適合人、大鼠和小鼠的圖譜分析。它的原理其實(shí)很簡單，就是384個定量PCR反應(yīng)在一塊微流量板上進(jìn)行。每個陣列的內(nèi)容與各自的Magaplex Primer Pools匹配，包含最多381個獨(dú)特的TaqMan MicroRNA Assays，有效縮短了準(zhǔn)備時間，并減少實(shí)驗(yàn)的不確定性。用Megaplex RT Primers反轉(zhuǎn)錄miRNA靶點(diǎn)及用Megaplex PreAmp Primers預(yù)擴(kuò)增之后，TaqMan Universal PCR Master Mix可與每個反應(yīng)簡單混合，并移至TaqMan Array的八個上樣口中之一，一個工作日內(nèi)就能產(chǎn)生覆蓋Sanger miRBase的綜合數(shù)據(jù)集。每個物種有一套兩個TaqMan MicroRNA Arrays。

不過要完成這個實(shí)驗(yàn)，7900定量PCR儀是必不可少的，而且還需要TLDA block才能完成。如果你附近找不到這臺儀器，那你可以考慮外包。上海生物芯片中心就提供相關(guān)的服務(wù)。你只需提供RNA樣品、TaqMan microRNA array，交給生物芯片公司就可以了。

目前已有多名用戶享受到了TaqMan MicroRNA Assay的優(yōu)勢，并驗(yàn)證了其有效性，文章發(fā)布在《Nature》、《Cell》、《Cancer Research》等雜志上。Lee等利用TaqMan MicroRNA assay和7900HT定量PCR儀，對10種早期擴(kuò)散性的鱗狀細(xì)胞癌和10種 正常的鱗狀上皮標(biāo)本的miRNA表達(dá)進(jìn)行了圖譜分析，發(fā)現(xiàn)了70種miRNAe表達(dá)存在顯著差異，其中68種上調(diào)，2種下調(diào)（2）。Si等利用TaqMan miRNA array對正常的乳腺組織和乳腺癌組織進(jìn)行了miRNA的表達(dá)圖譜分析。通過對5對配對樣本的比較，他們miR-21在癌組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織（3）。Resnick等則利用了TaqMan Array比較了9個卵巢癌標(biāo)本和4個正常標(biāo)本的miRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)8個miRNA表達(dá)差異顯著，其中5個上調(diào)，3個下調(diào)（4）。

參考文獻(xiàn)：
1. Meatdagh P, Feys T, Bernard N, et al. (2008) High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 1-8 doi:10.1093/nar/gkn725

2. Lee JW, Choi CH, Choi JJ, et al. (2008). AlteredMicroRNA Expression in Cervical Carcinomas. Clin Cancer Res 14(9): 2535-2542.

3. Si ML, Zhu S, Wu H, Lu Z, Wu F, Mo YY. (2007). miR-21-mediated tumor growth. Oncogene 26: 2799-2803.

4. Resnick KE, Alder H, Hagan JP, et al. (2008). The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform. Gynecologic Oncology Availiable online.

（生物通 余亮）