基于circRNA研究領域頂尖期刊和權威公共數據庫，運用強大的信息篩選系統，挑選出可靠的circRNA。
	剪接位點特異性探針與Rnase R預處理雙重保障，即便在相應線性RNA存在的情況下也能夠特異性檢測circRNA。
	數據報告提供circRNA可能結合的miRNA以及對應的host gene和線性RNA，便于從不同角度研究circRNA的作用機制。
	circRNA的特征決定了通過高通量測序的方法檢測結果不準確，Arraystar circRNA芯片可以恰到好處地破解這個難題。

circRNA競爭性吸附miRNA

        circRNA序列上含有大量的miRNA結合位點，當circRNA與miRNA同處于細胞漿時會引起circRNA對miRNA的吸附（miRNA sponge）。例如，通過PAR-CLIP實驗證實了ciRS-7與miR-7以及RNA誘導沉默復合體（RISC）重要組成成分AGO2蛋白結合；對生物素偶聯的miRNA進行pull down實驗，進一步驗證了ciRS-7吸附miR-7功能的存在。（圖1）

圖1. ciRS-7序列上含有七十多個miR-7結合位點，它可與miR-7以及AGO2蛋白結合。

circRNA調節RNA結合蛋白（RBP）

        circRNA可以與多種RNA結合蛋白（RBP）作用，進而發揮相應的分子生物學功能（圖2）；例如circRNA可以充當RBP的亞細胞轉移或定位的載體（圖3）、作為RBP的分子海綿，組裝RBP復合物以及作為酶活性調節的輔因子等。Antisense類型的circRNA還可以通過堿基互補配對的方式與相應的mRNA結合，進行調控mRNA的穩定性。

	圖2. circRNA與RNA結合蛋白（RBP）之間的相互作用
	圖3. circRNA在神經元胞體及樹突動態分布示意圖

circRNA的生物學功能

        miRNA分子調控生物體內1/3左右的基因，circRNA對miRNA的吸附會影響基因的表達，進而引起生物學表型或狀態的改變（圖4）。相當大一部分環狀RNA的靶標基因是介導信號傳導的蛋白激酶。研究還表明，circRNA的異常表達往往和臨床疾病相關，比如腫瘤、阿爾茨海默癥、動脈粥樣硬化等。

圖4. 斑馬魚胚胎過表達ciRS-7（右圖）會導致中腦（MB）縮小，而端腦（TC）大小不受影響。

circRNA的高穩定性

        circRNA分子獨特的閉合環狀結構，不受核酸外切酶影響，使circRNA的穩定性要遠遠高于同一個基因轉錄的相應線性RNA分子（圖5）。circRNA的高穩定性預示其非常適用于臨床biomarker研究。

圖5. circRNA在細胞內穩定性遠高于同一個基因轉錄的相應線性RNA，前者半衰期＞48h（右圖），而后者半衰期＜20h（左圖）。

circRNA高通量篩選的利器：RNA-seq or microarray？

        circRNA在細胞內含量極低，約占線性RNA的5-10%，通過測序獲得的circular junction reads 數目更低。RNA測序僅僅能有效檢測低于5% 的circRNAs（圖6），即便將測序量提高到300M reads，對于檢測準確度的影響也是微乎其微。
        測序不是circRNA高通量篩選的優質檢測手段，circRNA-seq需要雙端模式和極高的測序量。此外，后續的數據分析（如mapping所需數據庫、circRNA轉錄本組裝、特殊生物信息學算法、計算機篩選程序等）也存在一系列難題。由于上述因素所限，通過circRNA-seq發現新的circRNA的可能性幾乎為零。
        circRNA芯片采用特異性剪接位點探針與外切酶預處理雙重保障，能夠準確檢測樣本中circRNA的表達。芯片雜交不受RNA豐度的影響，即便在一個細胞中只含一個circRNA拷貝也能夠做到特異性檢測。此外，芯片避免了circRNA-seq復雜的建庫過程，其高效成熟的技術是circRNA高通量篩選的優質平臺。

圖6. 定量可靠的轉錄本比例與測序深度關系圖。RNA測序一般產生低于30M mRNA reads（藍圈），低于0.5M circular junction reads（紅圈），低于5%的circular junction真正得到有效檢測。（Adopted from Labaj et al, (2011) Bioinformatics [PMID 21685096].）

國際尖端circRNA研究利器

        Arraystar circRNA芯片是準確檢測樣本中circRNA含量理想的工具。剪接位點特異性探針與Rnase R預處理雙重保障，即便在相應線性RNA存在的情況下也能夠做到特異性檢測circRNA。數據報告中詳盡的circRNA注釋信息十分便于客戶進行circRNA機制研究。

圖7. circRNA芯片實驗大體流程（上圖）及詳細的circRNA注釋（下圖）： circRNA對應的線性RNA及miRNA的結合位點。

研究技術路線

        通過芯片篩選獲得組間差異表達的circRNA，接下來通過低通量circRNA-PCR的驗證（圖8）鎖定目標circRNA分子。目標circRNA分子可以展開不同方向的研究：臨床biomarker或功能機制（圖9）。

圖8. circRNA PCR驗證引物設計示意圖	圖9. circRNA基本研究思路示意圖

環狀RNA芯片參數

	Human	Mouse	Rat
Total Number of unique circRNAs	13,617	14,236	14,145
Probe Length	60nt	60nt	60nt
Probe Region	Circular junctions of circRNA
Probe Specificity	Transcript-specific
circRNA Enrichment	RNase R treatment
Labeling Method	Labeling by random primers
Circular RNA Sources
Salzman’s circRNAs (2013)	8,529
Memczak’s circRNAs (2013)	1,601	1,750
Zhang’s circRNAs (2013)	93
Zhang’s circRNAs (2014)	4,980
Jeck’s circRNAs (2014)	3,769
Guo’s circRNAs (2014)	5,536	570
You's circRNAs (2015)		13,300	12,298
Mouse circRNA orthologs			1,668
Human circRNA orthologs			179
Array Format	8 * 15K	8 * 15K	8 * 15K

參考文獻

[1] Guo, J. U., V. Agarwal, et al. (2014). "Expanded identification and characterization of mammalian circular RNAs." Genome Biol 15(7): 409.
[2] Jeck, W. R., J. A. Sorrentino, et al. (2013). "Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats." RNA 19(2): 141-157.
[3] Memczak, S., M. Jens, et al. (2013). "Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency." Nature 495(7441): 333-338.
[4] Salzman, J., R. E. Chen, et al. (2013). "Cell-type specific features of circular RNA expression." PLoS Genet 9(9): e1003777.
[5] Zhang, X. O., H. B. Wang, et al. (2014). "Complementary sequence-mediated exon circularization." Cell 159(1): 134-147.
[6] Zhang, Y., X. O. Zhang, et al. (2013). "Circular intronic long noncoding RNAs." Mol Cell 51(6): 792-806.
[7] You X. et. al. (2015) “Neural circular RNAs are derived from synaptic genes and regulated by development and plasticity.” Nat Neurosci. 
     2015 Apr;18(4):603-10
[8] Hentze and Preiss (2013) “Circular RNAs: splicing's enigma variations.” EMBO J 3;32(7):923-5.

康成生物是Arraystar公司在中國地區的唯一代理商，提供從樣品到數據分析的全程技術服務。